Egy érzékeny, UdgX-alapú uracil-DNS detektálás fejlesztése különböző organizmusokból származó, alacsony uraciltartalmú genomi DNS mintákon.
A genetikai információt hordozó DNS négy kanonikus bázist - timin, adenin, guanin és citozin –, illetve ún. nem-kanonikus bázisokat és bázismódosításokat tartalmaz. Ilyen például az 5-metil-citozin, 8-oxo-guanin, vagy az uracil. Utóbbi tulajdonképpen egy, a timinnel teljesen megegyező bázispár-képzési hajlamú, demetilált timin, mely normálisan az RNS-ben fordul elő. A DNS-be egyrészt replikáció során kerülhet timinanalógként emelkedett dUTP/dTTP esetén, másrészt a DNS-beli citozin dezaminálásaként spontán, vagy enzimkatalizálta reakció útján az AID/APOBEC fehérjecsalád tagjai által, melyek magasabb rendű élőlényekben az adaptív immunrendszer működéséhez elengedhetetlenek [1, 2]. A dezaminálásból származó U:G hibáspárok javítás nélkül, replikáció után fixált pontmutációkhoz vezetnek. A DNS-beli uracil (U:A, ill. U:G) javítása mindenekelőtt a báziskivágó javítás (base excision repair - BER), ill. esetenként a hibáspárjavítás (mismatch repair - MMR) folyamatok által történhet. A BER első lépését egy uracil-DNS-glikoziláz (UDG) végzi, mely hasítja a bázis és a cukor-foszfát gerinc közötti N-glikozidos kötést, egy abázikus helyet (AP-hely) létrehozva. Emlősökben a fő UDG az uracil-N’-glikoziláz (UNG) [3].
Annak ellenére, hogy a DNS-beli uracil általában hiba, az elmúlt évtizedben egyre több tanulmány támasztja alá, hogy néha mégis élettani vagy fejlődésbiológiai szereppel bírhat [4,5]. Így egyre erősebb igény jelentkezett különböző modellorganizmusok genomi uraciltartalmának érzékeny kimutatására. Ehhez számos módszert dolgoztak ki [6] többek között a kutatócsoportunkban is [7]. A laborunkban használt U-DNS szenzorokat elsősorban inaktív UNG mutáns alapján fejlesztették, amelyeket csepp blot, immunocitokémiás, valamint genom szekvenálási eljárásokban sikerrel alkalmaztak drogkezelt, magas uracil-tartalmú humán rákos sejtvonalak esetén [7]. A fiziológiáshoz közelebb álló alacsony uracil-tartalmú minták kvantitatív mérésére ezek a szenzorok kevésbé voltak alkalmasak, ezért fordultak egy különleges, az U-DNS-sel kovalens adduktot képző, Mycobacterium smegmatis-ban újonnan felfedezett UDG, azUdgX felé [7].
Kísérleteim során a laborban korábban előállított biotinilált Avitag-UdgX szenzor konstruktot használtam egyelőre csepp blot alkalmazásokban, két modellrendszerben is. Egyrészt a zebrahal embrionális fejlődésében, másrészt az U-DNS javítás enzimeiben mutáns egér szöveteken és sejtvonalakon. Az új UdgX szenzor egyértelműen nagyobb érzékenységűnek bizonyult. Ezzel együtt, kvantitativitás szempontjából a szenzorfehérje termelése és tisztítása valamint a csepp blot alkalmazása további optimizálást igényelt, amit a jelen TDK munkában szintén megcéloztunk.
1. Smith, H. C., Bennett, R. P., Kizilyer, A., McDougall, W. M., & Prohaska, K. M. (2012). Functions and regulation of the APOBEC family of proteins. In Seminars in Cell and Developmental Biology (Vol. 23, Issue 3, pp. 258–268). Elsevier Ltd. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2011.10.004
2. Sarno, A., Lundbæk, M., Liabakk, N. B., Arne Aas, P., Mjelle, R., Hagen, L., Sousa, M. M. L., Krokan, H. E., & Kavli, B. (2019). Uracil-DNA glycosylase UNG1 isoform variant supports class switch recombination and repairs nuclear genomic uracil. Nucleic Acids Research, 47(9), 4569–4589. https://doi.org/10.1093/nar/gkz145
3. Békési, A., Holub, E., Pálinkás, H. L., & Vértessy, B. G. (2021). Detection of genomic uracil patterns. In International Journal of Molecular Sciences (Vol. 22, Issue 8). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/ijms22083902
4. Liu, M., & Schatz, D. G. (2009). Balancing AID and DNA repair during somatic hypermutation. In Trends in Immunology (Vol. 30, Issue 4, pp. 173–181). https://doi.org/10.1016/j.it.2009.01.007
5. Muha V, Horváth A, Békési A, Pukáncsik M, Hodoscsek B, Merényi G, Róna G, Batki J, Kiss I, Jankovics F, Vilmos P, Erdélyi M, Vértessy BG. Uracil-containing DNA in Drosophila: stability, stage-specific accumulation, and developmental involvement. PLoS Genet. 2012;8(6):e1002738. doi: 10.1371/journal.pgen.1002738. Epub 2012 Jun 7. PMID: 22685418; PMCID: PMC3369950.
6. Sang, P. B., Srinath, T., Patil, A. G., Woo, E. J., & Varshney, U. (2015). A unique uracil-DNA binding protein of the uracil DNA glycosylase superfamily. Nucleic Acids Research, 43(17), 8452–8463. https://doi.org/10.1093/nar/gkv854
7. Róna, G., Scheer, I., Nagy, K., Pálinkás, H. L., Tihanyi, G., Borsos, M., Békési, A., & Vértessy, B. G. (2016). Detection of uracil within DNA using a sensitive labeling method for in vitro and cellular applications. Nucleic Acids Research, 44(3). https://doi.org/10.1093/nar/gkv977
szerző
-
Bukovszki Laura
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulens
-
Dr. Békési Angéla
tudományos munkatárs, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
