A dUTPáz enzim élettani hatásának vizsgálata CRISPR bázisszerkesztő módszerrel eukarióta sejteken
A dUTPáz a nukleotid metabolizmusban fontos szerepet játszó enzim, melynek feladata a dUTP hidrolízise dUMP-vé és pirofoszfáttá. Katalitikus aktivitása révén kettős szerepet tölt be, egyrészt csökkenti a sejtbeli dUTP/dTTP arányt, ezzel megakadályozza a dUTP DNS-be történő beépülését. Másrészt a keletkezett dUMP szubsztrátként szolgál a timidilát-szintáz enzim számára, így hozzájárul a dTTP de novo bioszintéziséhez. Ha a dUTP/dTTP arány magas, hasonló szerkezetük következtében dUTP is beépülhet a genomba. A DNS-ben található uracil kivágását az UDG enzimcsalád tagjai, az UNG és a SMUG1 enzimek végzik. Amennyiben az uracil bázis mennyisége megnő a DNS-ben, a báziskivágó javítás következtében kettős száltörések alakulhatnak ki, mely timinmentes sejthalálhoz vezethet. Míg az Ung -/- Smug1 -/- genotípusú egerek életképesek, és genomjuk uracil tartalma szignifikánsan magasabb a vad típusú egerekéhez képest [1], addig a Dut gén kiütése embrionális letalitást okoz [2]. A csoport jelenlegi eredményei alapján az Ung -/- Smug1 -/- Dut -/- genotípusú egerek nem életképesek. Ezért azt tűztem ki célul, hogy katalitikusan inaktív dUTPáz enzimmel rendelkező Ung -/- Smug1 -/- genotípusú MEF sejteket állítok elő, hogy vizsgáljam a dUTPáz enzim funkcionalitását. Katalitikusan inaktív enzimet CRISPR bázisszerkesztés alkalmazásával kívánok létrehozni, mely során a szerkeszteni kívánt genomi régiót egy gRNS szekvencia jelöli ki specifikusan, majd citozin dezamináció révén a kijelölt citozin bázis timinre cserélődik. A dUTPáz katalitikus aktivitásához szükséges vízmolekula koordinálását egy konzervált aszpartát aminosav teszi lehetővé, melyet E.coli-ban aszparaginra cserélve a szubsztrát kötésének képessége megmarad, viszont a hidrolitikus aktivitása teljesen lecsökken [3]. A tervezett mutáció a D100N volt, mivel egér sejtekben ez a mutáció felel meg a katalitikus aktivitásért felelős aszpartát aminosav cseréjének. D100N heterozigóta MEF sejtekből kiindulva a tervezett homozigóta genotípusú sejtek előállítása során vélhetően megváltozott kromoszómaszámú sejteket kaptam. Ennek igazolására kariotipizálást, illetve áramlási citometria alkalmazásával a DNS-tartalom meghatározását végeztem, mely módszerek lehetővé teszik a sejtek kromoszómaszámának megállapítását. Továbbá annak igazolására, hogy a dUTPáz enzim inaktív, dot blot módszerrel mértem a genomi uracil tartalmat, melynek eredménye megerősítette a sikeres bázisszerkesztést. Vizsgáltam emellett a dUTPáz enzim mRNS expresszióját RT-qPCR módszerrel az előállított D100N sejtvonalon, azonban különbéget nem találtam a különböző genotípusú MEF sejtek dUTPáz mRNS expressziójához képest.
[1] Alsøe L, Sarno A, Carracedo S, Domanska D, Dingler F, Lirussi L, SenGupta T, Tekin NB, Jobert L, Alexandrov LB, Galashevskaya A, Rada C, Sandve GK, Rognes T, Krokan HE, Nilsen H. Uracil Accumulation and Mutagenesis Dominated by Cytosine Deamination in CpG Dinucleotides in Mice Lacking UNG and SMUG1. Sci Rep. 2017 Aug 3;7(1):7199. doi: 10.1038/s41598-017-07314-5. PMID: 28775312; PMCID: PMC5543110.
[2] Pálinkás HL, Rácz GA, Gál Z, Hoffmann OI, Tihanyi G, Róna G, Gócza E, Hiripi L, Vértessy BG. CRISPR/Cas9-Mediated Knock-Out of dUTPase in Mice Leads to Early Embryonic Lethality. Biomolecules. 2019 Apr 4;9(4):136. doi: 10.3390/biom9040136. PMID: 30987342; PMCID: PMC6523736.
[3] O. Barabás, V. Pongrácz, J. Kovári, M. Wilmanns, and B. G. Vértessy, “Structural Insights into the Catalytic Mechanism of Phosphate Ester Hydrolysis by dUTPase,” J. Biol. Chem., vol. 279, no. 41, pp. 42907–42915, Oct. 2004, doi: 10.1074/JBC.M406135200.
szerző
-
Tóth Otília
Biotechnológia
mesterképzs (MA/MSc)
konzulens
-
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
