A dUTPáz és az Stl inhibitor fehérje kölcsönhatásának összehasonlító vizsgálata eukarióta és prokarióta enzimmodellen
A dUTPáz enzim a megfelelően alacsony dUTP/dTTP arány biztosításán keresztül központi szerepet tölt be a DNS épségének megőrzésében. Specifikus gátlásának lehetősége számos kutatás tárgyát képzi több elképzelhető terápiás vonatkozás miatt. Gyógyszercélpontnak ígérkezik például a tuberkulózis, a malária és bizonyos daganattípusok elleni küzdelemben is. Az utóbbi évek felfedezése, hogy a Staphylococcus aureus Φ11 helper fágjának dUTPáza képes kölcsönhatni a Staphylococcus aureus patogenitási szigetek kifejeződését gátló Stl represszor fehérjével, elindítva ezzel a virulencia faktorok átírását és horizontális átvitelét. A kutatócsoportunkban elvégzett részletesebb kinetikai vizsgálatok során igazolódott, hogy a Φ11 dUTPáz és az Stl fehérje közötti kölcsönhatás a dUTPáz aktivitás reverzíbilis gátlásával jár. Fény derült továbbá arra is, hogy az Stl képes a Mycobacterium tuberculosis (MTB) dUTPázával is komplex létrehozására és aktivitásának markáns gátlására.
Felvetődik a kérdés, hogy tekinthető-e az Stl fehérje univerzális dUTPáz inhibitornak. Bár a homotrimer szerkezetű dUTPázokra az aktív hely felépítését tekintve nagy fokú konzerváltság jellemző, a dUTPázok között fennállnak fajspecifikus eltérések. Jellegzetes különbség mutatkozik a prokarióta és eukarióta dUTPázok között a trimer kölcsönhatási felületen formálódó központi csatorna polaritásában, ami befolyásolhatja az Stl-lel való kölcsönhatást. Célom az eukarióta modellszervezetként használt ecetmuslica (Drosophila melanogaster) és a prokarióta modellszervezetként használt Escherichia coli dUTPáz enzim és az Stl fehérje kölcsönhatásának in vitro vizsgálata, majd a prokarióta és az eukarióta modell dUTPázzal kapott eredmények összehasonlító értékelése.
Kutatómunkám során a molekuláris biológia eszközeit felhasználva előállítottam az in vitro vizsgálatokhoz a fehérjéket. Az enzimaktivitás gátlás összehasonlítását követően a komplexképződés létrejöttét igazoltam termofluorimetriás méréssel és natív gélelektroforézissel. Ezután elektroforetikus mobilitás eltolódás mérést (EMSA) végeztem annak megállapítására, hogy a dUTPáz és az Stl kölcsönhatása előidézi-e a SaPIbov1 DNS szakaszról a represszor (Stl) leszorítását. Munkám végső fázisában a BME VBK Biostruct laborban végeztem kristályosítási kísérleteket. Eredményeim arra utalnak, hogy a prokarióta E. coli dUTPáz aktivitását az Stl fehérje nem gátolja, mégis feltételezhető közöttük valamilyen mértékű kölcsönhatás kialakulása. Az eukarióta D. melanogaster dUTPáz aktivitását ugyanakkor jelentősen gátolja a vizsgált fehérje inhibitor. Az eltérés pontos szerkezeti hátterére a fehérje komplexek sikeres kristályosítását követő röntgendiffrakciós vizsgálat adhat majd magyarázatot.
szerző
-
Pölöskei István
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Benedek András
PhD hallgató, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
