Represszió - derepresszió elven működő molekuláris kapcsoló karakterizálása Staphylococcus aureus-ban
A Staphylococcus aureus patogenicitási szigetei (SaPI) a baktérium fertőzőképességéért felelős géneket (toxin) kódolnak, szerepük a virulens gének terjesztése a baktérium populációk közt. A SaPI kifejeződését egy Stl nevezetű fehérje gátolja. A φ11 fág fertőzés következtében a fág dUTPáz fehérjéje kölcsönhatásba lép az Stl fehérjével, ezáltal derepresszálja a SaPI DNS kifejeződését, ami elindítja a kivágás-replikáció-csomagolás ciklusát. A Staphylococcus aureus fág dUTPáz egy bifunkciós enzim, dUTPáz aktivitása mellett az Stl fehérje derepresszióját szabályozza. Az aminosav-sorrend vizsgálat alapján egyes Staphylococcus fág dUTPázok (φ11 fág) tartalmaznak egy 40 aminosav hosszú szakaszt (inzert), amelynek az Stl kötésben feltételezhetően szerepe van.
A fág dUTPáz és az Stl fehérje tulajdonságait és a közöttük létrejött kölcsönhatás kialakulását különféle módszerek (spektrofotometria, analitikai gélszűrés, fluorimetria, EMSA) felhasználásával jellemeztem.
Vad típusú és inzert mentes φ11 dUTPázokkal elvégzett katalitikus aktivitás mérési vizsgálatok megmutatták, hogy a katalitikus aktivitás mértéke mindkét dUTPáz esetében hasonló, továbbá jól egyezik a humán vagy mikobaktérium (Mycobacterium tuberculosis) dUTPázok aktivitási adataival. Az Stl fehérje jelenlétében mind a vad, mind az inzert hiányos dUTPáz aktivitása is jelentős mértékben lecsökken. Elmondhatjuk, hogy az inzert jelenléte illetve hiánya sem a dUTPáz által katalizált reakciót, sem az Stl inhibiciót nem befolyásolja.
Analitikai gélszűréssel végzett, a fehérjék komplexképzésére vonatkozó vizsgálat megmutatta, hogy a háromféle fajból származó dUTPáz egyaránt képez komplexet az Stl fehérjével, bár a humán dUTPáz-Stl komplex jelenléte nem egyértelmű.
A fluorimetriás mérések igazolták, hogy a C terminális kar részt vesz a szubsztrát kötésben illetve megmutatták, hogy az inzertnek nincs jelentős hatása a szubsztrát kötődésre.
EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) módszerrel végzett kísérletekben a dUTPáz és az Stl kölcsönhatását vizsgáltam a az Stl feltételezett DNS kötőhelyének jelenlétében. Az eredmények az mutatják, hogy a dUTPáz Stl komplex kialakulásának hatására az Stl leválik a DNS-ről, az inzert mentes dUTPáz esetében viszont az Stl DNS kötés megmarad. Ezen eredmények alapján az inzert szerepét befolyásolja a DNS jelenléte a dUTPáz és az Stl kölcsönhatásának kialakulása során.
A dUTPáz Stl DNS komplex jellemzéshez további vizsgálatok szükségesek.
szerző
-
Kádár Veronika
biomérnöki
nappali
konzulensek
-
Dr. Németh Veronika
tudományos munkatárs, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, (külső)
