Humán dUTPáz inhibitor fehérje dimerizációjának perturbációja az inhibíciós hatás növelése érdekében
Humán dUTPáz inhibitor fehérje dimerizációjának perturbációja az inhibíciós hatás növelése érdekében
Laczkovich Máté, IV. évf. (BSc)
Témavezetők: Dr. Nnyíri Kinga egyetemi adjunktus
BME ABÉT
Konzulens: Dr. Vértessy G. Beáta egyetemi tanár
BME ABÉT
A dUTPáz aktivitás gátlásának hatására megnő a dUTP koncentráció, és így gyakrabban épül be uracil a DNS-be, ennek következtében az uracil-DNS hibajavító mechanizmus túlterhelődhet, ami DNS fragmentációhoz és sejthalálhoz vezet1. Ezért a genomi integritás fenntartásában kiemelt fontosságú dUTPáz enzim már évtizedek óta kutatások tárgyát képezi.
Korábban leírták, hogy egy bakteriofág dUTPáz fehérjéje kölcsönhatásba lép a Staphylococcus aureus patogenitási szigetet szabályozó Stl fehérjével, és a fehérje-fehérje komplexben a fág dUTPáz enizmaktivitása szinte teljes mértékben megszűnik2,3. Csoportunk kimutatta, hogy az Stl fehérje további számos faj dUTPáz fehérjéjével köztük az emberi dUTPázzal is képes kölcsönhatásba lépni4. A humán dUTPázra (hDUT) kifejtett inhibíció mértéke 70%, azonban a humán dUTPáz-Stl kötődési affinitása alapján az aktivitás mérés során alkalmazott koncentrációviszonyok mellett közel teljes inhibícióra lehetne számítani. A tapasztalt maradó aktivtás oka feltételezésünk szerint, hogy az Stl dimerizációs egyensúlya interferál a dUTPáz inhibícióval.
Munkám során olyan Stl variánst kívántam létrehozni, amely az eredetinél lényegesen nagyobb mértékben képes gátolni a humán dUTPáz enzimaktivitását. Az Stl dimerizációs felszíne (a fehérje C terminális szegmense, 175-267 aminosavak) és dUTPáz kölcsönható felszíne (a fehérje N-terminális szegmense, 55-120 aminosavak) egymástól jól elkülöníthetők5,6. Ezért olyan pontmutációkat terveztünk, amelyek feltehetőleg a monomer-képződés irányába tolják el az Stl-dUTPáz kölcsönhatással versengő Stl-dimerizációs egyensúlyt. Irányított mutagenezissel előállítottunk 6 pontmutánst (I181D, H188R, L192R, M242E, L245D, F196N), amelyeket bakteriális expressziós rendszerben termeltettem és affinitás kromatográfiával tisztítottam majd megvizsgáltam azok termális stabilitását és humán dUTPáz aktivitásra gyakorolt hatását.
Emellett vizsgálni kívántam, hogy a dimerizációért felelős Stl-175-267 szegmens (CT-Stl) a teljes hosszúságú Stl fehérjével képes-e heterodimert képezni és ez a folymat hatással van-e a dUTPáz inhibícióra. Ehhez a CT-Stl fehérjét kódoló expressziós vektort molekuláris klónozással létrehoztam. Ezt követően az előállított tisztított fehérjével végzett kémiai keresztkötési kísérleteim alapján megállípítottam, hogy a CT-Stl és a teljes hosszú Stl közötti heterodimer komplex képződik.
Ez azonban nem befolyásolja az Stl dUTPáz enzimre kifejtett inhibícióját, tehát ily módon nem sikerült növelni az Stl gátlóképességét. Eredményeim azonban arra utalnak, hogy az Stl dimerizációjáért nem kizárólag a vizsgált CT-Stl szegmens felelős. Az irodalomban azt feltételezték, hogy esetleg az 69-84 aminosavak által kialakított α5 hélixnek is szerepe lehet a dimerizációban és az R74A mutáció csökkenti az Stl dimer stabilitását ezért ezt a mutánst is előállítottam és karakterizáltam.
Az Stl-dimerizáció egysúlyi állanadójának meghatározására további vizsgálatokat tervezek végezni biolayer interferometriás módszerrel és hDUT-Stl komplexek kristályosítására is kísérletet teszek.
1 Vértessy, B. G. et al. Acc. Chem. Res. 42, 97–106 (2009)
2 Tormo-Más, M. Á. et al. Nature 465, 779–82 (2010)
3 Szabó, J. E. et al. Nucleic Acids Res. 42, 11912–20 (2014)
4 Nyíri, K. et al. Sci. Rep. 8, 4326 (2018)
5 Rafael Ciges-Tomas, J. et al. Nat. Commun. 10, 3676 (2019)
6 Nyíri, K. et al. Biomolecules 9, (2019)
szerző
-
Laczkovich Máté
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Dr. Nyíri Kinga
adjunktus, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
