Onkogén mutációt hordozó KRAS fehérjék csökkent GTPáz funkciójának helyreállítására tervezett GAP fehérje mutánsok vizsgálata
A humán daganatos megbetegedések esetében a RAS fehérje mutációja fordul elő leggyakrabban. A RAS fehérjének három izoformája ismert: KRAS, HRAS és NRAS. Az izoformák közül a KRAS mutációja kifejezetten gyakori hasnyálmirigyrák (86%) és vastagbélrák tumorokban (41%) valamint a tüdőadenokarcinómás esetekben (32%) [1]. A KRAS molekuláris kapcsolóként működik sejten belüli jelátviteli útvonalakban: GTP kötött állapotban képes a jeltovábbításra, GDP kötött állapotban pedig inaktív. A fehérje rendelkezik saját GTPáz aktivitással, ez azonban meglehetősen alacsony. A GTPáz aktiváló proteinek (GAP-ok) meggyorsítják a KRAS GTP hidrolízisét, ezáltal elősegítik a jelátvitel inaktivációját. Az onkogén KRAS mutánsok esetében viszont gyengébb a GAP-KRAS kölcsönhatás, emiatt fokozott a jeltovábbítás, ami kontrollálatlan sejtosztódáshoz, és tumorigenezishez vezet [2].
Munkám célja az volt, hogy olyan GAP-mutánsokat állítsak elő, melyek gyorsítják egyes onkogén KRAS mutánsok (G12C, G12D) inaktivációját, amely által esetleg kiküszöbölhetővé válhatna a hibás működés. A kutatást Dr. Rosta Edina által vezetett kutatócsoporttal (King’s College London) együttműködésben végezzük. Kollaborációs partnereink QM/MM számítások alapján olyan mutációkat azonosítottak a GAP fehérjén belül, amelyek feltehetőleg befolyásolják a GAP KRAS-hoz való kötődését.
Munkám során irányított mutagenezissel előállítottam a GAP mutánsok expressziójára alkalmas plazmidokat. Ezután bakteriális expressziós rendszerben termeltettem a mutáns GAP fehérjéket, majd sejtextraktumból izoláltam azokat. Ezt követően többféle módszerrel is megvizsgáltam, hogy az onkogén KRAS mutánsok aktivitására hogyan hatnak a GAP mutánsok. Az egyik esetben a mant-GTP fluoreszcens szubsztrátanalóg hidrolízisét követtem, így az enzimaktivitást közvetlenül detektáltam.
A másik az ún. MESG foszfát assay vizsgálat során a GTPáz aktivitás következtében keletkező inorganikus foszfát mennyiségét mértem közvetett módon. Ezen in silico és in vitro módszerek kombinációjával sikeresen azonosítottam néhány olyan GAP mutánst, amelyek a vadtípusú GAP-nál jelentősen nagyobb mértékben növelik a mutációt tartalmazó KRAS fehérjék GTPáz aktivitását.
Az így kapott eredményeim hozzájárulhatnak a KRAS mutáns daganatok új kezelési módszereinek fejlesztéséhez. Illetve a fehérjeszerkezetekre és az aktivitásban bekövetkező változásokra irányuló vizsgálatok hozzásegítenek minket a daganatok kialakulásában szerepet játszó fehérjék működési mechanizmusának mélyebb megértéséhez.
Irodalom
[1] A. R. Moore, S. C. Rosenberg, F. McCormick, and S. Malek, “RAS-targeted therapies: is the undruggable drugged?,” Nat. Rev. Drug Discov., vol. 19, no. 8, pp. 533–552, 2020.
[2] J. M. L. Ostrem and K. M. Shokat, “Direct small-molecule inhibitors of KRAS: From structural insights to mechanism-based design,” Nat. Rev. Drug Discov., vol. 15, no. 11, pp. 771–785, 2016.
szerző
-
Sólyom Ildikó
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Nyíri Kinga
, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Koppány Gergely
Tudományos segédmunkatárs, TTK, Enzimológiai Intézet (külső)
