Kvantitatív PCR humán genomi DNS-ből: a gén kópiaszám meghatározásának validálása és verifikálása az RCCX kópiaszám variációban
A kvantitatív polimeráz-láncreakció (qPCR) az utóbbi időben kiemelt figyelmet kapott a SARS-CoV-2 pandémiának köszönhetően, de a módszert vírusok kimutatása mellett gén kópiaszámok (gene copy number, GCN) meghatározására is használják. A GCN-ek gyakran a humán genom egyik legkomplexebb jelenségeit, a kópiaszám variációt (copy number variation, CNV) jellemzik.
Az RCCX CNV célgénjein (CYP21A1P és CYP21A2) - amelyek egy endokrin-genetikai rendellenességet, a veleszületett mellékvese hiperpláziát okozzák – két, hidrolízis próbákkal végzett duplex qPCR mérési rendszernek egy laboratóriumi validálását végeztük el 46 humán genomiális DNS-en, illetve nagyszámú pozitív kontroll párhuzamoson és kalibrációs görbe hígításon. Emellett verifikáltunk további öt qPCR rendszert, amelyek RCCX CNV genetikai elemeinek (C4A, C4B, HERV-K (C4) CNV deléció, HERV-K (C4) CNV inszerció és RCCX CNV töréspont) a GCN-jét mérik. Vizsgáltuk a qPCR rendszerek analitikai specificitását és érzékenységét, a linearitást, az ismételhetőséget, a reprodukálhatóságot, a pontosságot és a robusztusságot.
Mind a hét qPCR rendszer ismételhetősége és reprodukálhatósága (precizitása) 1,01 CV% alatt volt. A minták átlagos relatív hibája a GCN alapján (pontosság) 4,96 ± 4,08% és 9,91 ± 8,93% között mozgott a különböző qPCR rendszerekben. A pontosság nem követte szorosan a precizitást, de szignifikánsan korrelált az RPPH1 belső referencia génnel történő normalizálás hatékonyságával, a GCN „bizonytalanság”-ával és a GCN „félre-osztályzás”-ával (Spearman's ρ: 0,793-0,940, p> 0,0001; ρ = -0,671, p = 0,024; ρ = -0,769, p = 0,006). A genomi DNS-nek erős mátrixhatása volt megfigyelhető, de az RPPH1 csökkenteni látszott ezt a hatást. A célgénre nézve singleplex (target-singlepex) qPCR legjobb esetben is csak a 2 GCN-t tudta megkülönböztetni a 3 GCN-től. A 7 qPCR rendszer összes GCN-jének elemzése multiplex megközelítéssel 1,96% bizonytalan GCN-t eredményezett, és az összes egyértelmű GCN 100%-ban megfelelt a Southern blot, MLPA és a CGH metodikákkal mért GCN-eknek.
Arra a következtetésre jutottunk, hogy a belső (egy mérési rendszerben a célgénnel) referencia gén vagy gének, az allélspecifikus primerek vagy próbák, valamint a multiplex megközelítés (több célgén egy rendszerben vagy több rendszerben) döntő fontosságúak a GCN-ek qPCR-rel, valamint más módszerekkel történő meghatározásához.
szerző
-
Hargitai Petra
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulens
-
Dr. Doleschall Márton
tudományos főmunkatárs, Semmelweis Egyetem (külső)