Genom szintű uracil beépülési mintázatok vizsgálatára alkalmas szenzorfehérje továbbfejlesztése és alkalmazásának finomítása
A dezoxiribonukleinsavban (DNS-ben) az egyik leggyakrabban előforduló hibás bázis az uracil, mely a citozin spontán vagy enzimatikus dezaminációjával, de akár timint helyettesítő beépítéssel is létrejöhet. A citozin dezaminációval keletkezett U:G hibás bázispár pontmutációhoz vezet, amennyiben nem történik meg a javítása a következő replikációig, míg a timint helyettesítő uracil (U:A pár) nem okoz ilyen problémát (1,2). Ennek ellenére, ha a sejtbeli dUTP/dTTP arány ami normális esetben extrém alacsony megemelkedik, az uracil beépülése és/vagy az erre épülő folyamatok is végzetesek lehetnek a sejt számára. Sok kemoterápiában használt gyógyszer (pl.: raltitrexed, 5-fluoro-2’-dezoxiuridin (5FdUR)) éppen ezt használja ki és a de novo timidilát bioszintézis útvonalait támadva ún. timinmentes sejthalált indukál (3).
A DNS-beli uracil eltávolításáért az uracil-DNS-glikozilázok (UDG-k) felelnek. Az emberben legalább négyféle UDG található, melyek közül a legaktívabb az uracil-N-glikoziláz (UNG). Ez az U:A és az U:G párban lévő uracilt egyaránt képes felismerni, valamint változatos kontextusban lévő többféle uracil-származékot is javít (4,5).
Az uracilos DNS-nek (U-DNS) ugyanakkor fontos biológiai szerepe is lehet, például vírusokban (6,7), rovarok egyedfejlődésében (8) és az immunrendszer antitest termelésében (9,10), melyek megértéséhez és megfelelő leírásához egy hatékony U-DNS detektálási technika szükséges, a már meglévő mennyiségi meghatározást biztosítók mellett (11,12). Prof. Vértessy Beáta laborjában már létrehoztak több U-DNS szenzorfehérjét, amit sikeresen alkalmaztunk in situ immuncitokémiás festési eljárásokban, dot blot mérésekben és DNS-immunprecipitációhoz kapcsolt szekvenálási kísérletekben (U-DNA-Seq) (13,14). Bár a szenzorfehéréjével reprodukálható és koherens eredményeket kaptunk az uracil beépülést okozó raltitrexed és 5FdUR kezelt sejtek esetén (14), az alacsony uraciltartalmú mintáknál főként a dot blot mérések bizonytalanok. Úgy gondoljuk, hogy a szenzor szenzitivitása tovább javítható. Ezért a munkám során egy enzimatikusan biotinilált U-DNS szenzorfehérjét hoztam létre. Ez azért lehet érzékenyebb, mert a biotin-sztreptavidin különösen erős kölcsönhatást (Kd≈10 15M) (15) biztosít, másrészt a detektáló szenzor komplex jóval kisebb méretű (szteptavidin-HRP kb. 110 kDa, anti-FLAG-antitest + HRP konjugált másodlagos antitest kb. 340 kDa). A létrehozott új szenzorfehérjét a meglévő konstrukthoz hasonlítva teszteltem dot blot és U-DNS-IP alkalmazásokbana.
1. Krokan, H. E. PMID: 12483510; 2. Visnes, T. PMID: 19008197; 3. Blackledge, G. PMID: 95798534; 4. Kavli, B. PMID: 12161446; 5. Slupphaug, G. PMID: 7819187; 6. Yan, N. PMID: 21576478; 7. Kiljunen, S. PMID: 16339954; 8. Muha, V. PMID: 22685418; 9. Xu, Z., PMID: 22728528; 10. Liu, M. & Schatz, D. G. PMID: 19303358; 11. Horváth, A. & Vértessy, B. G. PMID: 20864450; 12. Lari, S. U. PMID: 16908222; 13. Róna, G. PMID: 26429970; 14. Pálinkás, H. L. PMID: 32956035; 15. Fairhead, M. & Howarth M., PMID: 25560075
szerző
-
Holub Eszter
Biomérnöki mesterképzési szak, nappali MSc
mesterképzés (MA/MSc)
konzulensek
-
Dr. Békési Angéla
tudományos munkatárs, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Pálinkás Hajnalka Laura
tudományos segédmunkatárs, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék