qPCR alapú diagnosztikai eljárás fejlesztése egér patogén protozoák kimutatására
Kísérleti állatok tartása során – a genetikai tartalom és a tartási paraméterek azonossága mellet – a mikorbiomnak is meg kell egyeznie. Az állatkísérletek hitelessége és összehasonlíthatósága miatt az egészségügyi állapot folyamatos monitorozása szükséges. Hagyományosan a protozoonokra való szűrést az állatok vakbeléből vett minta mikroszkópos vizsgálatával végzik, ami az állatok elhalálozásával jár, így nem követi az ún. 3R (replacement, reduction, refinement) alapelvet, azaz az állatkísérletekkel kapcsolatos uniós normákat. Ezzel szemben a DNS alapú kimutatási reakciók olcsóbbak, gyorsabbak és noninvazívak, mivel az egerek ürüléke is felhasználható mintaként. A célunk az volt, hogy qPCR alapú specifikus reakciót fejlesszünk egérpatogén protozoonok kimutatásához. Az NCBI nukleotid adatbázisból kikerestük a Tritrichomonas nemzetség 5,8S rRNS gén szekvenciáit, és többszörös illesztést (multiple alignment) készítettünk velük. Ennek alapján kijelöltünk egy erősen konzervált és egy specifikus régiót. Ezekre a szekvenciákra TaqMan reakciót terveztünk a Tritrichomonas muris specifikus és a Tritrichomonasok általános kimutatására. A Giardia nemzetségre jellemző a giardin fehérje megléte, így a Giardia muris esetében a giardin fehérjék génjét hasonlítottuk össze, és terveztünk erre is reakciót. Spironucleus muris kimutatásához is terveztünk reakciót a 16S rRNS gének összehasonlításával. Ezekhez a reakciókhoz, mivel nem volt pozitív kontroll mintánk, célszekvenciákat tartalmazó plazmid DNS-t készítettünk, amellyel teszteltük, és kalibráltuk a reakciókat. A DNS-izolálás validálására egy hatékonyabb belső kontroll reakciót fejlesztettünk az Enterococcus faecalis és az Escherichia coli 16S rRNS gének konszenzus szekvenciáira. Eredményeinket más diagnosztikai laborok is megerősítették. A kimutatási reakciókat különböző fluoreszcens festékek együttes alkalmazásával is teszteltük, amely költséghatékonyabbá teheti a módszert.
