Modell rendszer létrehozása a bakteriofág dUTPáz aktivitás horizontális géntranszferre gyakorolt hatásának vizsgálatára Staphylococcus aureus-ban
A Staphylococcus aureus törzsek genomjának közelítőleg 20%-át beékelődött mobilis genetikai elemek teszik ki, melyek sűrűn cserélődnek. Ezek az elemek gyakran hordoznak patogenitási faktorokat és antibiotikum rezisztenciért felelős géneket, így hozzájárulnak a baktérium fertőzőképességéhez, illetve a virulencia és az antibiotikum rezisztencia terjedéséhez. Szintén gyakran előfordul, hogy olyan géneket tartalmaznak, amelyek befolyásolják az uracil DNS hibajavítást. Ilyen például a bakteriofágok dUTPáz génje. A dUTPáz feladata, hogy megfelelő arányban tartsa a dUTP/dTTP arányt, ezzel akadályozva, hogy uracil kerüljön a DNS-be és mutagén elváltozások jelenjenek meg. Ezt a gént korábban eszenciálisnak tartották, maga a S. aureus saját genomja ( a mobilis genetikai elemktől mentes rész) viszont nem kódolja. Felmerül tehát a kérdés, hogy a baktérium hogyan él túl dUTPáz nélkül, illetve az is, hogy ha a baktériumnak nincs szüksége erre a génre, akkor a genomba integrálódó lizogenikus fágok miért hordozzák. Feltételezésünk szerint a mobilis genetikai elemek genetikai anyaga érzékenyebb a DNS uracil tartalmára, ezért a mobilis genetikai elemek, ebben az esetben a lizogenikus fágok terjedését segíti elő a dUTPáz jelenléte.
A témám legfőbb célkitűzése, hogy létre hozzak egy olyan modell rendszert, mely alkalmas arra, hogy a S. aureus bakteriofág dUTPáz enzimaktivitásának bakteriofágok szaporodásában betöltött szerepét vizsgálni lehessen. Ezt a legegyszerűbben úgy vizsgálható, ha egy adott bakteriofág dUTPázát gátoljuk a fág szaporodása közben. Ahhoz, hogy vizsgálni tudjuk, hogy a dUTPáz hogyan befolyásolja a fágok terjedését, szükség volt egy olyan lizogén törzsre, amely csak egy féle bakteriofágot tartalmaz (a legtöbb törzs 2-3 profágot tartalmaz), méghozzá, egy olyat amelynek aktivitása gátolható a rendelkezésünkre álló Stl nevű, fehérje természetű inhibitorral.
Erre a célra a ϕ 11 lizogént választottuk, mely dUTPáz enzime biztosan olyan trimer dUTPáz, amelyre hat az általunk ismert szekvenciájú Stl fehérje gátlása. Ennek érdekében egy több bakteriofágot is tartalmazó törzsben aktiváltuk a fágokat, majd azzal fogékony törzseket fertőztünk és megpróbáltunk kizárólagosan ϕ 11 profágot tartalmazó lizogén S. aureus törzset izolálni. Ehhez egy erre alkalmas a screenelési módszert is kifejlesztettünk.A létrehozott lizogéneket új generációs szekvenálással is vizsgáltuk. Ezután az Stl fehérjét egy S. aureus-E. coli ingázó expressziós vektorba klónoztuk, aminek a segítségével az inhibitor fehérjét kifejezhetjük a vizsgálni kívánt törzsben. Ellenőriztük azt is, hogy az általunk izolált lizogén törzs képes-e felvenni S. aureus-E. coli ingázó expressziós vektorokat.
A létrehozott és tesztelt modell rendszerrel a jövőben vizsgálni tudjuk, hogy a dUTPáz enzim aktivitása hogyan befolyásolja a fágok terjedését és a horizontális géntranszfert.
