Specifikus aminosav jelölési stratégia fejlesztése és kiterjesztése humán plazmamembrán transzmembrán fehérjék vizsgálatára
Kutatócsoportunk által korábban kifejlesztett nagyáteresztő képességű kísérletek lényege, hogy az ép sejtek plazmamembrán fehérjéinek extra-citoszólikus oldalon hozzáférhető lizin oldalláncait biotin funkciós csoportot tartalmazó speciális reagenssel jelölik. A sejtek lizálása, membránpreparátumok készítése és a jelölt peptidek tisztítása után tandem tömegspektrometria segítségével azonosítják a jelölés szekvencián belüli helyét.
Munkám során célul tűztem ki egy újfajta jelölési stratégia kidolgozását, amely az aszparaginsav és glutaminsav oldalláncok hasonló módon való jelölésére, módosítására épül. A karboxil csoportok irodalmi adatok alapján csak több lépésben módosíthatóak, előbb egy aktiválási, majd egy jelölési műveletet kell alkalmaznunk.
A stratégia kifejlesztését egy egyedi tisztított modellfehérjén kezdtem, majd az egyes paraméterek optimalizálását követően élő sejteken végzett kísérletekkel folytattam. A vizsgálandó transzmembrán fehérjék izolálását követően, a jelölt pozíciók dúsítására az ismert nagy affinitású avidin-biotin kölcsönhatáson alapuló affinitás kromatográfiát alkalmaztam, amelynek segítségével specifikusan megkötöttem a biotinált oldalláncot tartalmazó peptideket. Eluáláskor egy redukciós lépésben hasadnak el a jelölő reagensben lévő diszulfid hidak, a keletkezett eluátumban a kovalens módosítást tartalmazó peptidek HPLC-MS/MS módszerrel azonosíthatóak.
A transzmembrán fehérjék extracelluláris oldalán levő karboxil oldalláncok specifikus jelölésével lehetőségünk nyílt a jelölt fehérjék szerkezetének a jobb megismerésére, mivel az azonosított pozíciókat extracelluláris megszorításként lehet használni a CCTOP topológia becslő algoritmusban. Megmutattam, hogy a karboxil oldalláncok jelölése egy lehetséges alternatívája az eredeti kísérleti protokollnak.
szerző
-
Müller Anna
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulens
-
Dr. Tusnády Gábor
tudományos főmunkatárs, MTA TTK Enzimológiai Intézet (külső)
