Inhibitor tesztkaszkád fejlesztés a rákkutatásban kiemelt jelentőségű KRAS fehérje targetre

A KRAS a sejtnövekedést, differenciálódást és sejtciklust szabályozó jelátviteli folyamatokban molekuláris kapcsolóként működő guanin nukleotid kötő fehérjék csoportjába tartozik. A fehérje GTP-kötött állapotban olyan térszerkezetet vesz fel, amely képes a jeltovábbítási út további elemeihez csatlakozni, míg GDP kötött állapotban a jeltovábbítás szünetel. Az aktivációt guanin-nukleotid kicserélő faktorok, mint például a SOS fehérje, az inaktivációt pedig a GTPáz aktiváló fehérjék katalizálják [1]. A KRAS fehérje egyes mutációi állandósítják a jeltovábbítást, ami a sejt korlátlan növekedését idézi elő így daganatos elváltozás kialakulásához vezethet. A mutáns KRAS fehérjék a legelterjedtebb onkogének, a rákos megbetegedések közel 25 százaléka esetében fontos szerepet játszanak. A KRAS mutációk által okozott hasnyálmirigyrák illetve tüdőrák jellemzően nehezen kezelhető [2].

Bár a KRAS mutánsok onkogén tulajdonsága régóta ismert, mindeddig nem sikerült olyan gyógyszert kifejleszteni, amely kellően hatékony és specifikus ahhoz, hogy a gyógyászatban használni lehessen. A közelmúltban azonban sikerült ígéretes gyógyszerjelölteket előállítani, amelyek a KRAS G12C mutáns ciszteinjéhez kötődnek kovalens kötéssel [3]. Ez biztosítja mind az inhibitorok specifikusságát, mind a gyógyszer-fehérje kölcsönhatás erősségét. Ezen vegyületek továbbfejlesztésével lehetőség nyílhat egy olyan molekula előállítására, ami megfelel a gyógyszerként való alkalmazhatóság feltételeinek.

Kutatásom célja a KRAS fehérje G12C mutánsára ható kovalens inhibitorok fejlesztése volt. Ehhez elsőként a KRAS-4B gén vad típusát és a G12C mutánst klónoztam pET-15b-TEV vektorba, majd a plazmidokat fehérjetermelő E. coli sejtbe transzformálva termeltem és izoláltam a KRAS G12C fehérjét. Hasonló módon előállítottam a funkcionális tesztekhez szükséges SOS fehérjét.

Ezt követően felállítottunk egy olyan biokémiai tesztkaszkádot, amellyel nagy mintaszám esetén is gyorsan és kevés anyagköltséggel lehet az inhibitor jelölteket szelektálni. A kaszkád első lépésében az inhibitorok reaktivitását teszteltem, olyan módon, hogy a mintákban található szabad cisztein mennyiségét határoztam meg és ez alapján következtettem az inhibitor-kötött G12C mutáns KRAS arányára. A második lépés során differenciális pásztázó fluorimetriás módszert alkalmazva vizsgáltam a fehérje és a fehérje-inhibitor komplexek hőstabilitását. Végül fluoreszcens nukleotid analógok jelenlétében mértem a nukleotid-kicserélődés sebességét.

Fent említett módszereket laboratóriumunk körülményeihez adaptáltam, és érvényességüket a szakirodalomban leírt kovalens inhibitorokat referenciaként használva igazoltam. Ezt követően in silico predikciós módszerekkel tervezett inhibitorok hatását teszteltem. Sikeresen kimutattam az inhibitorok kötődését a célfehérjéhez, és azok hatását a KRAS aktivációra.

Ezzel párhuzamosan a fragmens alapú gyógyszerfejlesztési megközelítést is alkalmaztuk a kovalens KRAS-inhibitorok kutatásában. Ez alapján elsőként a kovalens kötés kialakításáért felelős reaktív csoportot tartalmazó kismolekulákat (fragmenseket) vizsgáltunk. Munkám következő lépése a leghatékonyabbnak bizonyult fragmens találatok validálása lesz. Ezt követően a kiválasztott jelölteket fokozatosan növelve egy pontosan a KRAS kötőzsebébe illeszkedő inhibitort kívánunk előállítani.

[1] M. V Milburn et al., “Molecular switch for signal transduction: structural differences between active and inactive forms of protooncogenic ras proteins.,” Science (80-. )., vol. 247, no. 4945, pp. 939–945, 1990.

[2] I. a Prior, P. D. Lewis, and C. Mattos, “A comprehensive survey of Ras mutations in cancer,” Cancer Res., vol. 72, no. 10, pp. 2457–2467, 2012.

[3] J. M. Ostrem, U. Peters, M. L. Sos, J. A. Wells, and K. M. Shokat, “K-Ras(G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions,” Nature, vol. 503, no. 7477, pp. 548–551, 2013.

szerző

Koppány Gergely
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)

konzulensek

Nyíri Kinga
, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

helyezés

BME Egyetemi Hallgatói Képviselet I. helyezett