Apo Petroselinum Crispum fenilalanin ammónia-liáz szerkezete "loop-on" konformációban
Petroselinum Crispum fenilalanin ammónia-liáz (PcPAL) a természetben az ammónia nem-oxidatív eliminációját katalizálja fenilalaninról transz-fahéjsavat, és ammóniát eredményezve. Az enzim a 3,5-dihidro-5-metilidén-4H-imidazol-4-on (MIO) enzimcsoporthoz tartozik, amelyek az aktív centrumukban MIO csoportot tartalmaznak. A PAL-ok főleg növényekben találhatóak ahol fontos szerepük van egy stressz indukálta növényi reakcióban a fenilpropanoid útvonalban. Továbbá PAL-ok találhatóak néhány gomba, és baktérium fajban ahol katabolikus enzimként fordulnak elő, illetve másodlagos anyagcseretermékek szintézisében vesznek részt.[1] Ennek a munkának a célja, hogy az apo-PcPAL szerkezetét meghatározzuk, és vizsgáljuk a ligand kötődés módját ligand soakolásos módszerrel.
Az előző tanulmányokban az N-terminális His10-tag megakadályozta az apo-PcPAL kristályosodását. A probléma megoldásának első lépése, hogy a PcPAL DNS szekvenciáját pET15b vektorba klónoztuk ami egy His6-taget, és egy Tobacco etch vírus proteáz (TEV) hasítóhelyet tartalmazott. A TEV számunkra egy könnyebben hozzáférhető enzim volt mint az előzőleg használt enterokináz, és így el tudtuk távolítani a kb. 25 aminosav hosszú rendezetlen régiót a fehérjetisztítás után.
A klónozást a PcPAL termelésének, és tisztításának az optimalizálása követte. Az optimalizált kitermelés 20 mg/l tisztított fehérje volt. A TEV első termelése a csoportban 20 reakcióra elegendő enzimet eredményezett. A kristályosításhoz 10 mg/ml koncentrációjú PcPAL –ból indultunk ki.
Három kereskedelmi forgalomban lévő HTP screent (SG1, JCSG, PACT) használtunk ami 288 különböző körülményt tartalmazott az apo-PcPAL kristályosításához. Hét körülményben találtunk ígéretes kristályokat, amikből a legjobb hármat az 1. Táblázat tartalmazza. A legjobb három körülmény összetétele: SG1 (25% PEG 3350), SG1 (20%, PEG 3350, 0.2 M KNO3), JCSG (20% PEG 3350, 0.2 M K-formiát). Az optimalizálás során sikerült a röntgendiffrakcióhoz szükséges minőségű egykristályokat kapni. Együttműködő partnerünk, a kiválasztott kristályokból elkészítette a röntgendiffrakciós méréseket, a triszeti szinkrotronban. A szerkezetről 1.9 Å felbontásban kaptunk adatkészletet.
[1] Lovelock SL, Turner NJ. Bioorganic Med Chem. 2014;22(20):5555-5557.
szerző
-
Molnár Bence
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Dr. Bata Zsófia
Tanszéki Mérnök, Szerves Kémia és Technológia Tanszék -
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Dr. Poppe László
egyetemi tanár, Szerves Kémia és Technológia Tanszék
