Alternatív enzimek használata tömegspektrometria alapú proteomikában
A kromatográfiával kapcsolt tandem tömegspektrometria (MS/MS) az utóbbi években a fehérjeanalitika elengedhetetlen eszközévé vált. A fehérjéket leggyakrabban tripszines emésztéssel előállított peptidjeik MS/MS spektruma alapján azonosítjuk, melyeket fehérjeadatbázis alapján feltételezett peptidek elméleti spektrumával hasonlítunk össze. Az egyes peptid-spektrum találatok megbízhatóságát pontszámmal jellemezzük. Az azonosítás sikere függ a kísérleti paraméterektől (pl. CID ütközési energia) és a kiértékeléshez használt szoftvertől is. Sokszor a tripszin helyett más specificitású emésztőenzimek előnyösebbek, így ezek használata is egyre elterjedtebb. Ugyanakkor mind az MS/MS paraméterek optimálása, mind a bioinformatikai eszközök fejlesztése során a triptikus peptidek voltak fókuszban.
A kutatásaim során azt vizsgáltam, hogyan függ az alternatív enzimes hasítással képződő peptidek adatbázis keresésen alapuló azonosításának megbízhatósága az MS/MS mérés során alkalmazott ütközési energiától. Célul tűztem ki a nem-triptikus peptidek fragmentációs viselkedésének megismerését és megértését, valamint a kapott eredmények alapján hatékonyabb protokoll tervezését.
A kísérleteket nagyszámú, változatos méretű és tulajdonságú peptidre végeztem el, amelyeket humán vérplazma többféle enzimmel (tripszin, Arg-C, Glu-C, Asp-N és kimotripszin) történő emésztésével állítottam elő. A kiértékelés során kétféle keresőmotort is alkalmaztam. Vizsgáltam energiafüggő MS/MS mérésekkel peptidek különféle csoportjaira (m/z, töltés, méret, enzimspecificitás) a legbiztosabb azonosítást eredményező ütközési energiákat, és statisztikai módszerekkel feltérképeztem az ezeket befolyásoló peptidtulajdonságokat.
Eredményeim alapján az enzimspecificitás jelentős hatással bír. Bár az Arg-C-vel kapott peptidek a triptikusokkal analóg módon viselkednek, a Glu-C, Asp-N és kimotripszin esetében az optimális energia 5-10 eV-tal kisebbnek adódik. A jelenség az előbbi enzimek y-fragmensionjainak kiemelkedő stabilitására vezethető vissza, melyet a C terminálisnál lévő bázikus oldallánc eredményez.
Az adatok alapján hatékonyabb MS-alapú analízismódszert javasoltunk nem-triptikus peptidek vizsgálatára. A teljesítőképességre vonatkozó tesztkísérletek során az általunk optimált módszerrel 27%-kal több peptidet és 14%-kal több fehérjét azonosítottunk.
szerző
-
Sándor Péter
Vegyészmérnöki mesterképzési szak, nappali MSc
mesterképzés (MA/MSc)
konzulensek
-
Révész Ágnes
tudományos munkatárs, Természettudományi Kutatóközpont (külső) -
Dr. Lakné Komka Kinga
egyetemi adjunktus, Kémiai és Környezeti Folyamatmérnöki Tanszék
