Staphylococcus aureus transzkripciós faktor Mycobacterium tuberculosis dUTPáz-ra gyakorolt gátló hatásának mechanizmusa
A genom integritás szabályozásában résztvevő fehérjék gyakori célpontként szolgálnak a különböző megbetegedések kezelésére alkalmazott gyógyszerek tervezésében. Ilyen célpont lehet a sejt számára esszenciális dUTPáz enzim is, melynek specifikus gátlása számos kutatás tárgyát képezi.
Az irodalomban közölt eredmények alapján a Staphylococcus aureus Φ11 fággal történő fertőzése során, a fág dUTPáz enzime képes kölcsönhatásba lépni egy, a S. aureus-ban található, Stl nevű represszor fehérjével. Csoportunk a dUTPáz és az Stl között kialakuló kölcsönhatás vizsgálatába kezdett, mely során kimutatta, hogy az Stl gátolja a Φ11 dUTPáz enzim aktivitását. Az is kiderült, hogy az Stl nem csupán a Φ11 dUTPáz-t képes gátolni, hanem más dUTPáz-okat is, többek között a Mycobacterium tuberculosis-ban (MTB) található dUTPáz-t. A gátlás fajspecifikus elemeinek feltárása fontos információkkal szolgálhat további inhibitorok tervezéséhez. Az egyes dUTPáz-ok és az Stl fehérje közötti kölcsönhatás jellemzése megalapozhatja az Stl fehérje dUTPáz inhibitorként történő in vivo használatát. Így a dUTPáz gátlás in vivo hatásai könnyen vizsgálhatóvá válhatnak.
Munkám célja az Stl és a Mycobacterium tuberculosis dUTPáz közötti kölcsönhatás in vitro módszerekkel történő jellemzése volt.
Megállapítottam, hogy Stl jelenlétében az MTB dUTPáz aktivitásában erőteljes csökkenés mutatható ki, mely a Φ11 dUTPáz-tól eltérően nem 100 %-os. Meghatároztam, hogy hasonlóan a Φ11 dUTPáz és az Stl kölcsönhatásához, az Stl és a MTB dUTPáz között is egy lassú, de erős kötődésen keresztül megvalósuló inhibíció jön létre. Ebben a speciális esetben nem teljesülnek a steady-state feltételek, ezért a kölcsönhatás behatóbb vizsgálatához, triptofán fluoreszcencián alapuló tranziens kinetikai módszereket alkalmaztam. Ehhez egy az aktív helyén triptofán mutációt tartalmazó MTB dUTPáz variánst használtam. A vad típusú és a triptofánt tartalmazó dUTPáz variáns Stl-el kialakított kölcsönhatásában nem tapasztaltam eltérést. Fluoriméter, valamint stopped-flow berendezések segítségével megállapítottam, hogy az Stl jelenléte a szubsztrát megkötésével interferál, de a Φ11 dUTPáz-nál megfigyeltektől eltérően.
Munkám során jellemeztem az Stl MTB dUTPáz-ra gyakorolt gátlásának főbb aspektusait, mely megalapozta, hogy az Stl segítségével in vivo, Mycobacterium smegmatis-ban is vizsgálni tudjuk a dUTPáz gátlás hatását a DNS anyagcserére és a DNS uracil tartalmára. A gátlási mechanizmus mélyrehatóbb vizsgálatával számos eredménnyel járultam hozzá a vizsgált fehérjék közötti kölcsönhatás kialakulásának, valamint a gátlás mechanizmusának megértéséhez, illetve a gátlás fajspecifikus eleminek azonosításához.
