Egy uracil szenzor in vitro és in vivo alkalmazási lehetőségei

Szerző: Tihanyi Gergely, II. évfolyam, Vegyészmérnök BSc.

Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta egyetemi tanár

BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

MTA TTK Enzimológiai Intézet

Konzulens: Róna Gergely tudományos segédmunkatárs

BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

MTA TTK Enzimológia Intézet

A DNS-be számos hiba kerülhet különböző mechanizmusok szerint. Egy gyakran megjelenő hiba az uracil, egy nitrogéntartalmú heterociklusos bázis, mely az RNS molekulák természetes alkotóeleme. Az uracil megjelenése történhet a DNS replikáció során beépüléssel, mivel szerkezetileg igen hasonló a timinhez, valamint a citozin spontán oxidatív dezaminálódása következtében. Az élőlényekben több enzimcsalád szakosodott e hibák korrekciójára, melyek közül az emberben a legaktívabb – az uracil-DNS-glikoziláz családhoz tartozó – UNG enzim.

Laboratóriumunkban létrehoztak egy olyan módosított UNG fehérjét, amely képes specifikusan megkötődni az uracilhoz, ám nem vágja ki azt. Ezzel a fehérjével képesek vagyunk kvantitatívan meghatározni a DNS-beli uracil mennyiségét. Ez orvosbiológiai vonatkozásban is különösen fontos, hiszen a mai kemoterápiás szerek jelentős része a de novo timidilát szintézis gátlásán keresztül hat. Kutatásom célja egy új, érzékeny és könnyen alkalmazható, kvantitatív uracil-meghatározási módszer kifejlesztése és optimalizálása volt. A mérés ELISA módszeren alapszik, a DNS-beli uracilhoz kötött UNG fehérje mennyiségét határozza meg, antitestekhez kötött enzimreakciók segítségével. Méréseim során kemoterápiás drogokkal (5FdUR) kezelt és kezeletlen egér embrionális fibroblaszt, és Escherichia coli sejtek DNS-ét használtam fel. A megfelelő kezelési körülmények tesztelése, és a sejtek DNS-ének optimális izolálásának kidolgozása, szintén a feladatom volt. Az in vitro kvantifikálás mellett, ugyanezen módosított UNG és egy piros fluoreszcens fehérje (DsRed) fúziójával létrehozott konstrukcióval, in vivo vizsgálatokat is végeztem. Ezek során egér embrionális fibroblaszt sejtekben próbáltam mesterségesen bejuttatott magas uracil-tartalmú extrakromoszómális DNS-t specifikusan jelölni, immunocitokémiai módszerekkel. A festés detektáláshoz nagy felbontású konfokális mikroszkópiát használtam.

A kutatásaim során sikeresen kifejlesztettem egy ELISA módszert, mely alkalmas nagy érzékenységgel, számos organizmusból kinyert DNS minták uracil mennyiségének meghatározására. Továbbá a továbbfejlesztett uracil szenzorral sikerült in vivo uracilt jelölnöm egér embrionális fibroblasztokban. Reményeim szerint a módszer egyszerűsége, és reprodukálhatósága miatt a későbbiekben diagnosztikai célokra is felhasználható lesz, annak gyors eldöntésére, hogy a beteg mennyire érzékenyen reagál azokra a kemoterápiás szerekre, melyek ezt az anyagcsere útvonalat érintik.

szerző

Tihanyi Gergely
biomérnöki
nappali

konzulensek

Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
Róna Gergely
tudományos segédmunkatárs, MTA, TTK, Enzimológiai Intézet (külső)

helyezés

I. helyezett