A genomi uracil előfordulásának és eloszlásának vizsgálata

Összefoglaló

Nagy Kinga, MSc. II. évf.

Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta egyetemi tanár

BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Konzulens: Scheer Ildikó PhD. hallgató

BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Az uracil a természetben az RNS egyik alkotóeleme, a DNS-ben való megjelenése általában hibának számít, amit az élőlényekben az evolúció során kialakult javító mechanizmus távolít el. Az uracil a DNS-ben normál élettani körülmények között is előfordulhat, például egyes bakteriofágok DNS-e timin helyett uracilt tartalmaz, továbbá a B-limfociták esetében is fontos szerepet játszik a sejtek DNS-ében megjelenő uracil. Akár hibaként, akár normális élettani folyamat eredményeként fordul elő ez a szokatlan bázis, a DNS-en belüli eloszlása lényegi információval szolgálna a mutációra különösen hajlamos forró pontok (hot spot) felmérésében.

TDK munkám célja az uracil DNS-beli előfordulásának és eloszlásának vizsgálatára alkalmas új módszer kidolgozása és valamint optimalizálása, mivel a jelenleg elérhető módszerek nem alkalmasak a DNS-en belüli uracil-mintázat felmérésére.

Erre egy speciális Dot blot technikát dolgoztunk ki, amely során egy katalitikusan inaktív, de uracil felismerésre képes (D145N és H268N mutáns) uracil-DNS glikoziláz enzimet használtunk a DNS-ben található uracil detektálására. A módszer előnyei közé tartozik, hogy nagyon specifikus az uracilra, a teljes genomi DNS uracil-tartalmáról és annak eloszlásáról egyaránt kvantitatív információt szolgáltat, valamint, hogy nem csupán in vitro, hanem in situ ill. in vivo kísérletekben is alkalmazható lehet.

Munkám során a fent említett duplamutáns enzim konstruktokat funkcionális agaróz-assay-vel vizsgáltam, míg a DNS kötő képességüket elektroforetikus mobilitás teszttel (EMSA) jellemeztem. Ezekkel az enzim konstruktokkal számos kísérletet végeztem a Dot blot technika optimalizálására. Emellett az említett elven működő uracil-kimutatás érzékenyítésére ELISA kísérleteket is végeztem, immuncitokémiát pedig in situ vizsgálatként alkalmaztam.

szerző

Kelemenné Dr. Nagy Kinga
biomérnöki
nappali

konzulens

Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék