A genom integritását biztosító mechanizmusok vizsgálata humán sejtvonalakban helyspecifikus biallélikus génkiütés technológiával

Élő szervezetekben a genomi integritás megőrzését számos élettani folyamat látja el. Kiemelt jelentőséggel bír a dUTPáz enzim, ami a dUTP-t dUMP-vé és pirofoszfáttá hidrolizálja, biztosítva ezzel a sejtekben az alacsony dUTP/dTTP arányt, ezáltal a genom uracilmentességét. Az enzim esszenciálisnak bizonyult baktériumokban, élesztőben, Arabidopsisban és Drosophilában is, ahol a dUTPáz hiánya sejthalálhoz vezetett. A dUTPáz hiánya által kiváltott timin-mentes sejthalál mechanizmusa kevéssé ismert, jóllehet ennek indukálása a klinikumban széles körben elterjedt: a rákellenes szerek közel egyharmada ezen útvonal érintésével fejti ki hatását (fluoropirimidinek, methotrexát és származékai). A dUTPáz túlműködése részleges rezisztenciát okoz a fluoropirimidinekkel szemben, hiánya pedig érzékenyít, ennél fogva különösen fontos a fehérje működésének és szerepének alaposabb megismerése. A gén szerepét emlős rendszerekben eddig csupán csendesítéssel vizsgálták, génkiütést még nem írtak le.

Kutatási célunk a dUTPáz gén kiütése által okozott sejthalál mechanizmus vizsgálata humán sejtvonalon, ezáltal a kemoterápiás ágensekkel szembeni rezisztencia jobb megértése. Ehhez egy nemrég kifejlesztett, úttörő módszert használunk, mely a tetszőleges DNS szekvenciát felismerő cink-ujj nukleázok (ZFN-ek) révén mindkét allélon lehetővé teszi a helyspecifikus genomi manipulációkat (tetszőleges gének kiütése, ill. menekítő konstruktok bevitele). Esszenciális gén (a dUTPáz várhatóan emlős rendszerben is ilyen) kiütését azonban meg kell előznie a fehérje kondicionális menekítése, mert enélkül nem lehetne életképes kiütött sejtvonalat létrehozni. A menekítéshez a genom egy másik ismert pontjára egy olyan konstrukciót építettünk be, ami a dUTPáz sejtmagi és mitokondriális izoformáját egyaránt exogén módon biztosítja. Ez az exogén dUTPáz forrás azonban tetszőleges időpontban megszüntethető egy indukálható aktivitású Cre rekombináz segítségével. A menekítő kazetta ellenőrzését követően szeretnénk megkísérelni az endogén dUTPáz kiütését.

A létrehozott indukálható dUTPáz kiütött sejtvonal lehetővé teszi a dUTPáz genomi integritás megőrzésében és a klinikai terápiában játszott szerepének jobb megértését, a timin-mentes sejthalál útvonal eddig nem tanulmányozott részleteinek megismerését. Az általunk kifejlesztett kombinált génkiütési/menekítési stratégia pedig alkalmas lehet egyéb potencionálisan esszenciális gének vizsgálatára is.

szerző

Pálinkás Hajnalka Laura
biomérnöki
nappali

konzulens

Róna Gergely
tudományos segédmunkatárs, MTA, TTK, Enzimológiai Intézet (külső)