Zebrahal dUTPáz fehérje szerkezetének, fejlődésbiológiai szerepének és kölcsönhatásainak vizsgálata
A zebrahal (Danio rerio) könnyű szaporíthatósága és áttetsző teste folytán az orvos-biológiai kutatásokban egyik leggyakrabban alkalmazott modellorganizmus, amely alkalmas humán szervi rendellenességek és betegségek kezelési lehetőségeinek in vivo kutatására. Azonban nem irányult még kutatás a humán kemoterápiákban célpontként alkalmazott timidilát bioszintézis és dUTP metabolizmus vizsgálatára ebben az organizmusban. A közelmúltban a kutatócsoportunk által fejlesztett módszerrel munkatársaim szokatlanul magas a dUTP szintet detektáltak zebrahal embrió sejtekben. Ez a legtöbb élőlényben a DNS hibajavító mechanizmusok túlműködését okozza és végső soron a genom töredezéséhez majd sejthalálhoz vezet, azonban a zebrahal embriókban ez fiziológiás állapotnak tűnik. Kutatócsoportunk további vizsgálatokat folytatott, amelyek során humán dUTP nukleotidohidroláz (dUTPáz) enzimet juttattak az embriókba, aminek hatására a sejtekben lecsökkent a dUTP szint, de ugyanakkor az embriók halálához is vezetett. Fennáll a kérdés, hogy a sejthalál az alacsonyabb dUTP szint, vagy a humán dUTPáz valamilyen más káros mellékhatása miatt következett-e be.
Munkám célja a zebrahal és humán dUTPáz egymással való összehasonlítása és karakterizálása volt. Mivel a zebrahal dUTPáz enzim szerkezetéről még csak predikciós modellek állnak rendelkezésünkre, ezért célom volt a fehérje szerkezetének röntgenkrisztallográfiás felderítéséhez szükséges fehérjekristály előállítása. Ehhez a fehérjét heterológ expressziós rendszerben termeltettem és tiszta formában izoláltam, majd ezt követően sikeresen kristályosítottam. Emellett másik célom volt megvizsgálni, hogy a humán dUTPáz esetében inhibitorként ható Stl fehérje kölcsönhatásba lép-e a zebrahal dUTPázzal és gátolja-e annak aktivitását, ugyanis amennyiben az Stl hatékony inhibitornak bizonyul, akkor hasznos lehet a dUTPáz szerepének felderítésére a zebrahal későbbi életszakaszaiban. A fehérjék komplexképződését termofluorimetriás, bioréteginterferometriás és enzimaktivitás méréssel vizsgáltam és a két fehérje komplexének szerkezetmeghatározásához alkalmas kristályokat is előállítottam. Végül mutációkat terveztem az Stl-dUTPáz kölcsönhatás erősítésére, majd meghatároztam az így kapott pontmutáns Stl fehérjék inhibíciós potenciálját.
szerző
-
Dombovári Dániel
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Dr. Nyíri Kinga
adjunktus, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Perey-Simon Viktória Berta
PhD hallgató, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék