Kemoterápiás szerekkel indukált mutagenezis kimutatása 3D-PCR-rel
A kemoterápiás szereket a rákterápiában használják, mert hatékonyan elpusztítanak rákos sejteket, vagy előidéznek olyan biokémiai folyamatokat, amelyek a rákos sejtek pusztulását eredményezik. Sok kemoterápiás szer a DNS-szintézist gátolja, de vannak olyanok is, amelyek károsítják a DNS-t, mutagén hatásúak lehetnek. A DNS károsodása következtében a sejtben aktiválódnak a különböző javító mechanizmusok, és megpróbálják kijavítani a hibákat. Ha viszont a hibajavítás még több hibát generál, akkor a javító mechanizmus hiperaktiválódik, és citotoxikus intermedierek képződnek, amik sejthalált eredményeznek. Ennek a folyamatnak az előidézése viszont felhasználható a rákterápiában. Ilyen rákterápiás stratégia a timidilát bioszintézis gátlása is, mely egyrészt gátolja a DNS szintézist azáltal, hogy a szükséges dTTP építőkő termelődése gátolt, másrészt egy emelkedett dUTP/dTTP arány miatt az uracil DNS-be épülését serkenti, ami hibaként értelmeződik a javító mechanizmusok számára. Az uracil DNS-be épülését kettő kulcsfontosságú enzim hivatott megelőzni, illetve akadályozni: a dUTPáz és a timidilát-szintáz. Van kettő gyakran használt kemoterápiás szer, amelyek a timidilát-szintázzal kölcsönhatásba lépnek, akadályozva funkcióját: az 5-fluoro-2’-dezoxiuridin (5FdUR) és a Raltitrexed (RTX) antifolát. Ezek az ágensek a timidilát-szintáz gátlásával megemelik a dUTP/dTTP intracelluláris arányát, megnövelve a valószínűségét az uracil DNS-be épülésének. Bizonyos ágensek használata esetén DNS-javításban deficiens genetikai háttéren másodlagos mutagenezist figyeltek meg, ami a terápiás szándékkal szemben katalizálja a tumorprogressziót, és drogrezisztenciát is okozhat. Az egyik leggyakoribb mutagén átalakulás a DNS-bázisok körében az ún. C-T átmenet, amely során a DNS-beli citozin uracillá alakul egy dezamináció eredményeként. Ahhoz, hogy pontosabban megértsük, milyen tényezőkön múlik a mutagén mellékhatás megjelenése, fontos lenne, hogy a C-T mutációkat hatékonyan ki tudjuk mutatni a genomi DNS-ben. Egy erre alkalmas, de bonyolult és drága módszer a genomszekvenálás. Kísérleteim célja volt egy PCR-alapú technika, a 3D-PCR beállítása és tesztelése 5FdUR-kezelt sejtekből (amelyekben az uracil-DNS-glikozilázok és a hibáspár-javítás gátolva voltak) izolált DNS-en, hogy egy egyszerűbben és gyorsabban kivitelezhető módszert találjak a C-T mutáció detektálására. A primerek beszerzése és a specificitás vizsgálata után elkészítettem a 3D-PCR-hez a templátokat agaróz gélelektroforézissel, majd a gélből izoláltam és tisztítottam őket. A PCR termékekkel több gradiens PCR-t is végrehajtottam, az ígéretesebbnek tűnő mintákkal egészen finom felbontásút is. De nem volt észlelhető nagy eltérés a kezeletlen és 5FdUR-kezelt minták között. Néhány általam megfelelőnek minősített mintával qPCR-t hajtottam végre, hogy élő képet kapjak a termékek koncentrációjáról. Először a primerek hatásfokát derítettem ki, utána gradiens qPCR-t hajtottam végre egy megengedő és egy limitáló hőmérsékleten. Az amplifikációs és olvadási görbék mutattak eltérést a két hőmérséklet mintái között, és az 5FdUR-kezelt minták termékei a limitáló hőmérsékleten hamarabb feljöttek, mint a kezeletlenek, de be kellett bizonyosodni, hogy ez nem a tömegkülönbségből fakadt. Ezt agaróz gélelektroforézissel döntöttem el, és voltak főtermékek a pozitív kontroll esetében, amelyek megegyeztek, azaz lehetséges, hogy a kezelt minták limitáló hőmérsékleten való nagyobb aktivitása a C-T mutáció eredménye.
szerző
-
Mócza Levente András
Vegyészmérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Dr. Békési Angéla
tudományos munkatárs, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Holub Eszter
PhD hallgató, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológia Doktori Iskola (külső)