Az onkogén KRas fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálata
A humán daganatos megbetegedések jelentős hányadának kiváltó oka a Ras gén funkcióvesztéssel járó mutációja. A Ras fehérjecsalád tagjai a KRas fehérjék, amelyek GTPáz aktivitásuknak köszönhetően képesek a jelátviteli útvonalak szabályozására, ezáltal részt vesznek a sejtek proliferációs és osztódásos folyamatainak irányításában. Működésüket segítik a GAP (GTPase activating protein) fehérjék, melyek nagyságrendekkel képesek megnövelni a GTP GDP-vé történő hidrolízisét. A KRas fehérjék aktív centrumában történt mutáció esetén azonban a KRas-GAP közti kölcsönhatás legyengül, ami gátolja a sejtfolyamatok megfelelő működését, így az kontrollálatlan sejtosztódáshoz és daganatos megbetegedések kialakulásához vezet. A közelmúltban felfedezték, hogy az RGS3 fehérje képes a mutáns KRas fehérjékhez is kötődni és a GAP-nál nagyobb mértékben aktiválni azokat, azonban fiziológiás működést ez sem képes visszaállítani.
A KRas jelátvitel helyreállítására már több megközelítéssel is törekednek, az inaktív GDP-kötött állapotot rögzítő kismolekulás terápiát már alkalmazzák is az orvosi gyakorlatban. Azonban a kezdeti tapasztalatok azt mutatják, hogy ezen kezelés hatására viszonylag gyorsan rezisztencia alakul ki a daganatokban. Ezért a KRas mutációt hordozó sejtek működésének helyreállításához további kutatások és új megközelítések szükségesek. A KRas mutánsok és a GAP, illetve RGS3 fehérjék kölcsönhatásának vizsgálatával új hatásmechanizmusú KRas jelátvitelt szabályozó molekulák fejleszthetők. Kutatásom során ezeket a kölcsönhatásokat vizsgáltam.
Kulcsfontosságú szerepe ellenére a KRas GAP katalizálta hidrolízisének mechanizmusa még jelenleg sem tisztázott. Egy kollaboráció keretén belül munkatársaim in silico QM/MM szimulációkkal felállítottak egy modellt, amelynek segítségével szisztematikusan olyan GAP mutánsokat terveztek, amik képesek voltak aktiválni a leggyakrabban előforduló KRas mutánsokat (G12C és G12D). Annak érdekében, hogy ezt a modellt a gyakorlatban is próbára tegyem bakteriális expresszióval előállítottam a KRas G12D fehérjét, illetve a szimulációval kapott legígéretesebb GAP variánsokat (L902E, L902Q, R903A és R903Q). A segédfehérjék hidroláz aktivitásra gyakorolt hatását MESG-PNP enzimaktivitásmérő esszé segítségével követtem nyomon. Emellett kölcsönhatásukat bioréteg interferometriás módszer segítségével vizsgáltam. Kutatásom részét képezte az RGS3, GAP-jellegű fehérje KRas G12D-re gyakorolt hatásának vizsgálata. Ennek elvégzésre szintén az enzimaktivitást mérő és bioréteg interferometriás módszert alkalmaztam. Kísérletet tettem továbbá a KRas-RGS3 fehérje komplex kristályosítására.
szerző
-
Emődi Nikolett
Biotechnológia
mesterképzs (MA/MSc)
konzulens
-
Dr. Nyíri Kinga
adjunktus, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
