Különböző genomi uracil kvantifikáló módszerek optimalizálása, és alkalmazása teljes átalakulással fejlődő rovarokban
Az uracil jelenléte a genomi DNS-ben a leggyakoribb hibák egyike. A citozin dezamináció során keletkező uracil pontmutációt eredményezhet. A hiba elleni védekezés preventív módjának effektora a dUTP-t dUMP-vé alakító dUTPáz. A DNS-be beépült uracil eltávolításáért az UDG (uracil-DNS-glikoziláz) enzimcsalád tagjai felelősek, amely család leghatékonyabb tagja az UNG. Az uracil sokszor fiziológiás körülmények közt is jelen van a DNS-ben. Bizonyos bakteriofágoknak dezoxitimidin helyett dezoxiuracil van a DNS-ében. A HIV vírus DNS-e is nagy számban tartalmaz uracilt, és a B-limfocitáink érésekor is fontos szerepet játszik. Érdekes módon a teljes átalakulással fejlődő rovarokban nincs jelen az UNG, és az ide tartozó ecetmuslica differenciált lárva szöveteiben nincs dUTPáz expresszió sem. Emellett azt is kimutatták, hogy az ecetmuslica lárvákban, és bábban is megemelkedik a genomi uracil szint.
Kísérleteim célja az volt, hogy ecetmuslicán kívüli egyéb különböző rendszertani kategóriákba tartozó teljes átalakulással fejlődő rovarok esetében (lisztbogár, selyemlepke, házi méh) is megvizsgáljam a genomi uracil alakulását, amelyhez 3 módszert is alkalmaztam.
Munkám során egy qPCR alapú genomi uracil kvantifikáló módszert1 optimalizáltam lisztbogárra. Ezen technika két polimerázon alapszik: a Pfu (Pyrococcus furiosus) polimeráz uracilhoz érve leállítja a polimerizációt; a Taq polimeráz ezen hibára azonban érzéketlen. Másik módszerként kvantifikálásra a „dot blot” nevű technikát2 alkalmaztam, amely egy katalitikusan inaktív, uracilt specifikusan felismerő UNG enzimet használ, majd a mennyiségi meghatározás antitestek segítségével, egy ELISA alapú módszerrel történik. Ezen módszert továbbfejlesztettem: egy új bioszenzort, egy frissen felfedezett fehérjét, az UDG enzimcsalád UDGX nevű tagját előállítva, és sikeresen alkalmazva. Ezen fehérje egy nem az UNG családba tartozó, nagy uracil specifitású UDG, amely eredendően katalitikusan inaktív.
Referenciák: 1. Horváth és Vértessy. Nucleic Acids. Res. 2010.
2. Róna et al. Nucleic Acids. Res. 2016.
szerző
-
Takács Gergely
Vegyészmérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
Scheer Ildikó Zsófia
doktorjelölt, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék