A genomban található uracil molekulák in situ meghatározására alkalmas jelző fehérje-rendszer kifejlesztése

Az élőlények DNS-ében számos módosulás mehet végbe, melyek közül az egyik leggyakoribb az uracil megjelenése, amely egyrészt a citozin oxidatív dezaminációjának terméke, másrészt a DNS-polimerázok építhetik be timin helyett, melyhez szerkezetileg igen hasonló. Több enzimcsalád is ismert, melynek feladata az uracil beépülés kivágással történő javítása, melyek közül az emberben a legaktívabb az uracil-DNS-glikoziláz családhoz tartozó UNG.

Laboratóriumunkban korábban módosították az UNG enzimet, így az továbbra is specifikusan képes kötődni a DNS-beli uracilhoz, ám nem vágja ki azt. Ennek segítségével képesek vagyunk különböző organizmusokból származó DNS minták uraciltartalmát meghatározni egy általunk kifejlesztett ELISA-szerű módszerrel.

Kutatásom célja ezen módosított UNG fehérje továbbfejlesztése volt, hogy in situ humán eredetű sejtvonalakban is jelölni tudjuk a genomi uracilt. Ehhez először emelkedett uracilszintet hoztam létre a sejtekben kemoterápiás szer (5-fluoro-2’-dezoxiuridin) kezeléssel, valamint az ung gén RNS interferencia általi csendesítésével. A kezelések optimalizálása után sikerült kimutatnom az uracilszint növekedését a genomi DNS preparátumban.

Ezt követően létrehoztam egy új konstrukciót a módosított UNG és a SNAP-tag fehérjék fúziójával. A SNAP-tag egy újonnan felfedezett módosított fehérje, amely irreverzibilis kovalens kötést képes létesíteni fotoaktiválható benzilguanin származékokkal, ami fluoreszcencia megjelenését váltja ki, így lehetővé téve számunkra az uracil molekulák rendkívül érzékeny jelölését és kimutatását. Az immunocitokémiai festési eljárást először baktérium, majd humán sejtes mintákon optimalizáltam és validáltam.

Munkám során humán vastagbélrák eredetű sejtek genomi uracilszintjét növeltem meg különböző kezelésekkel, majd ezt in situ sikeresen jelöltem egy általam létrehozott fehérje konstrukcióval. A módszer továbbfejlesztésével elérhető akár egyedi uracil molekulák specifikus jelölése, illetve vizsgálható az uracil genomi eloszlása szuperrezolúciós mikroszkópia segítségével. Kutatásainkat ebben az irányban folytatjuk, így módszerünk a jövőben lehetővé teszi a genomban dinamikus módon jelenlevő uracil szerepének feltárását olyan sejtbeli folyamatokban, mint az immunoglobulin gének szomatikus hipermutációja, vagy a rákellenes terápia hatására történő uracil beépülés.

szerző

Tihanyi Gergely
Vegyészmérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)

konzulensek

Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
Róna Gergely
tudományos segédmunkatárs, MTA, TTK, Enzimológiai Intézet (külső)