Katalitikus eljárások alkalmazása mikroRNS-ek meghatározásához képalkotó felületi plazmon rezonanciával
A mikroRNS-ek egyszálú, jellemzően 19-25 nukleotid hosszú, fehérjét nem kódoló RNS-ek, melyek többsége szövetspecifikus. Rendellenes expressziójuk különböző betegségekkel hozható összefüggésbe, például daganatos, kardiovaszkuláris, autoimmun megbetegedésekkel, diabétesszel, idegrendszeri-, vese-, és májdiszfunkciókkal. Ezáltal ígéretes diagnosztikai és prognosztikus biomarkerek lehetnek. Azonban a mikroRNS-ek rendkívül kis koncentrációban fordulnak elő a keringésben, ezért − hogy a diagnosztikában biomarkerként szerepet kapjanak − olyan megbízható méréstechnikák kifejlesztésére van szükség, amelyek alkalmasak ilyen kis koncentrációk mérésére. Kutatócsoportunkban célul tűztük ki, képalkotó felületi plazmon rezonanciás (SPRi) platformon alapuló mikroRNS diagnosztikai panel fejlesztését peptid-nukleinsav (PNS) felismerő szálak alkalmazásával. Az SPRi nagy áteresztőképességű technika és kiválóan alkalmazható valós idejű kötődési kinetikák meghatározására is, azonban érzékenysége nem éri el a diagnosztikai célú mikroRNS meghatározáshoz szükséges koncentrációtartományt. Dolgozatom célja az SPRi detektálással kompatibilis katalitikus jelerősítési módszerek fejlesztése volt, mellyel elérhető a kívánt kimutatási határ. Modellként a hsa-miR-208a mikroRNS-t választottuk, melynek koncentrációja szívizomsérülések esetén növekszik meg a vérben, ezáltal korai fázisban lehetővé teszi a szívinfarktus diagnosztizálását. Munkám során jelerősítésre alkalmas izotermikus amplifikáción, valamint poliadenilációs reakción alapuló módszereket dolgoztam ki a kimutatási határ csökkentésére. Az oldatfázisban lejátszódó izotermikus amplifikáció (NASBA-Nucleic Acid Sequence Based Amplification) során három enzim együttes működésének eredményeként a kiindulási mikroRNS szekvencia exponenciálisan sokszorosítható. A poliadenilációs reakció egy univerzális, felületi jelerősítési módszer, melynek során a mikroRNS 3’-terminálisán poli(A)-lánc jön létre. A poliadenin szál szintézisét a timin lánccal módosított arany nanorészecskék hibridizációján alapuló érzékenyítés követi. A módszerek szelektivitását az SPRi chip aranyfelületére immobilizált hsa-miR-208a szekvenciájával komplementer PNS szálak biztosítják. Így a kidolgozott jelerősítési módszerek szelektív, valós időben követhető mikroRNS detektálást, valamint hat nagyságrendű erősítést tesznek lehetővé.
szerző
-
Bognár Zsófia
Vegyészmérnöki mesterképzési szak, nappali MSc
mesterképzés (MA/MSc)
konzulensek
-
Dr. Gyurcsányi Róbert
egyetemi docens, (külső) -
Simon László Ferenc
PhD hallgató, Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék
