Dúsítási módszer komplex fehérjekeverék glikozilációs mintázatának meghatározására
Az élő szervezetben a fehérjék poszt-transzlációs módosulásai jelentős szerepet töltenek be, melyek közül egyik leggyakoribb a glikoziláció. Glikoproteinek vizsgálata során tipikusan enzimatikus hasítással előállított peptidkeveréket mintaelőkészítés és kromatográfiás elválasztást követően tömegspektrometriával jellemezzük. A mérési eredmények értékelése adatbázisok segítségével történik.
Biológiai minták analízise során az elsődleges probléma a minta nagy komplexitása, a korlátozott mintamennyiség, és a proteinekhez viszonyított alacsony relatív mennyiség. Ezek csökkentésére a mintákat tisztítani, és dúsítani kell. Ezek a mintaelőkészítési lépések jellemzően kromatográfiás eljárások. Jelen kutatási projekt keretén belül célunk egy olyan egyszerű és gyors dúsítási módszer kidolgozása volt, mely nagy komplexitású és kis mennyiségű minták esetén is alkalmazható.
Munkánk során egy acetonos kicsapási módszert fejlesztettünk tovább, melynek alapja a peptidek és glikopeptidek eltérő oldhatósága. Modellanyagként immortalizált HeLa sejtvonal emésztményt használtunk, amely nagy komplexitású biológiai minta, glikoproteomikai karakterizációja nem teljes. A módszer optimálása során több szempontból értékeltük a dúsítás eredményességét: meghatároztuk a dúsítási faktort, valamint vizsgáltuk a glikozilációs mintázat állandóságát az eljárás során.
Az eredmények értékelése során megállapítottuk, hogy az optimalizálás 10-szeres dúsulást eredményez a glikozilációs mintázat állandósága mellett. A módszerfejlesztéssel párhuzamosan meghatároztuk számos glikoprotein eddig nem ismert glikozilációs mintázatát, melyet a sikeres dúsítási eljárás és a mérési eredmények megfelelő értékelésére alkalmas módszer kidolgozása tett lehetővé.
szerző
-
Sugár Simon
Vegyészmérnöki mesterképzési szak, nappali MSc
mesterképzés (MA/MSc)
konzulens
-
Dr. Turiák Lilla
tudományos főmunkatárs, Természettudományi Kutatóközpont (külső)
