A glutation redoxpuffer állapotának analízise biológiai mintákban – fiziológiás és patológiás vonatkozások
A sejtek redox homeosztázisának egyik legfontosabb komponense a glutation. A tiol/diszulfid redoxpár megfelelő aránya segíti más antioxidánsok regenerálódását, véd az oxidatív stressztől, és jelenléte alapvető feltétele a fehérjékben történő, láncon belüli és láncok közötti diszulfid hidak kialakulásának, ezzel pedig az endoplazmás retikulum (ER) lumenében végbemenő fehérje hajtogatódásnak. A redukált (GSH) és oxidált (GSSG) glutation aránya függ a minta típusától (szövet, vér, szérum, sejtkultúra stb.) valamint az organellumtól és a redox státusztól is. A celluláris arány széles határok között mozog. A citoszolikus arány általában 30:1 és 100:1 között változik, az ER lumenében azonban a sajátos redox homeosztázis miatt az arány ennél sokkal alacsonyabb, 1:1 és 3:1 között mozog. A redox párok megfelelő aránya alapvető fontosságú a sejtek megfelelő működéséhez, ezért mennyiségük és arányuk pontos meghatározása elengedhetetlen a biokémiai kutatásban.
Az analízis szempontjából kihívást jelent egyrészt a kis mennyiségű rendelkezésre álló minta, másrészt pedig a mérendő anyagok instabilitása. Általánosan elfogadott mérési módszer, hogy a GSSG mennyiségét nem közvetlenül, hanem közvetve határozzák meg. A GSSG teljes mennyiségét GSH-vá alakítják, és a GSH szint növekedéséből következtetnek a GSSG mennyiségére. A mi célunk egy olyan módszer kidolgozása volt, ahol a redox pár mindkét tagját közvetlenül és egyidejűleg tudjuk meghatározni. Ehhez a HPLC-MS/MS módszert választottuk. Figyelembe véve, hogy e készülékek érzékenysége – kiváltképp komplex biológiai mátrixok esetén – a mérés folyamán változhat, szükségünk volt egy megfelelően kiválasztott belső standardra is. Erre a célra a metil GSH-t választottuk.
Először a módszert ellenőriztük oly módon, hogy a GSH/GSSG arányt kémiai módszerekkel (terc-butil-hidroperoxidos oxidáció, illetve ditiotreitolos redukció) toltuk el, és teszteltük, hogy az általunk kidolgozott módszerrel kapott eredmények megfelelnek-e az anyagmérleg követelményeinek (az egyik anyag fogyásának mértéke megfelel-e a másik anyag növekedésének mértékével). Ezen ellenőrzést mikroszóma-, illetve sejtmintákra is elvégeztük.
Mivel a szabad zsírsavak magas koncentrációban jelentős oxidatív stresszt okozhatnak a sejtekben (lipotoxicitás), vizsgálatainkat különböző zsírsavakkal kezelt mintákra is kiterjesztjük, ahol cél a glutation redoxállapot megváltozásának nyomonkövetése.
szerző
-
Becskereki Gergely
Vegyészmérnöki mesterképzési szak, nappali MSc
mesterképzés (MA/MSc)
konzulens
-
Dr. Tóth Blanka
egyetemi docens, Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék