Sejtben található, dezoxiribonukleotid trifoszfátok fluoreszcens meghatározására kifejlesztett mérés optimalizációja
A sejteknek szüksége van egy pontosan szabályozott dezoxiribonukleotid 5’-trifoszfát készlet (dNTP készlet) fenntartására. Az ebben a készletben bekövetkező zavarások a mutációs ráta növekedéséhez vezethetnek. Így a dNTP készlet megzavarása a mutációs ráta növekedésén keresztül gyógyszerrezisztencia kialakulásához vezethet, akár a tuberkulózis kórokozójában, a Mycobacterium tuberculosisban is. Ezért, ennek az egyensúlynak a kutatása kiemelt jelentőséggel bírhat a tuberkulózis elleni harcban, hiszen ez a betegség napjainkban is sok áldozatot követel [1]. Hogy ezt megfelelően tudjuk kutatni, Mycobacterium smegmatisban (egy nem-patogén modellorganizmusa a Mycobacterium tuberculosisnak) szükségünk van egy nagy áteresztőképességű, megbízható dNTP meghatározási módszerre. Ehhez egy, viszonylag új, DNS polimeráz aktivitáson alapuló fluoreszcens mérési technikát választottunk [2].
A dNTP-k meghatározása realtime-PCR-ben történik, a mérés során fluoreszcens jel szabadul fel, úgy, hogy a Taq polimeráz exonukláz aktivitása révén az egyébként kioltott fluoreszcens próbáról lehasítja a fluorofórt. A polimeráz akkor éri el a próbát, ha dNTP-ket felhasználva végigszintetizálja a primertől kezdve a templát komplementer szálát [1 ábra]. Ennek hatására a jel arányos lesz a limitáló dNTP mennyiségével.
Ezt a módszert korábban még bakteriális mintákban nem nagyon használták, ezért munkám célja az volt, hogy beállítsam a módszert az általunk tervezett mérésekhez. Ehhez optimalizáltam a mérés költségét, a használt komponensek koncentrációját, valamint új, enzimkinetikán alapuló módszert vezettem be a kiértékelésre. Az újfajta kiértékelés során a mérés működésével kapcsolatban olyan alapvető jellegzetességeket is felfedeztünk, amelyek befolyásolhatják a módszer alkalmazásával kapott korábbi és jövőbeni eredményeket. Az optimalizálás eredményeit és az újonnan felfedezett tulajdonságokat figyelembe véve a módszert sikeresen alkalmaztuk baktériumok dNTP készletének meghatározására.
[1] WHO Global tuberculosis report ISBN 978 92 4 156539 4
[2] & ábra: Wilson, P. M. et al. Nucleic Acids Res. 2011, 39, e112.
szerző
-
Mébold Bence
Biomérnöki alapképzési szak, nappali BSC
alapképzés (BA/BSc)
konzulensek
-
Dr. Vértessy G. Beáta
egyetemi tanár, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék -
-
Dr. Tóth Judit
tudományos főmunkatárs, MTA TTK Enzimológiai Intézet (külső)